本发明公开了一种可区分检测生物硫醇的荧光探针及其制备方法,特征是将2-氰基-6氨基苯并噻唑溶解在吡啶中与2, 4-二硝基苯磺酰氯通过一步液相反应,再用乙酸乙酯萃取收集上层溶液并旋干得到油状物,经高效液相色谱分离提纯,收集在紫外320纳米处有强吸收组分,即结构式为的荧光探针。本发明的合成方法步骤少,产率高,亲水性好;利用本发明制备的荧光探针可与半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽分别作用后生成的荧光产物分别在522纳米、517纳米和490纳米产生很强的荧光发射峰,可用来检测、区分半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽这三种生物硫醇,从而可进一步应用于体外及细胞内区分检测生物硫醇的目的。