本发明属于基因工程领域，提供一种大肠杆菌基因组中目的基因的遗传改造方法。鉴于现有的大肠杆菌基因组遗传改造方法存在操作步骤复杂或无法实现无痕改造的缺陷，本发明提供了一种新的对基因组中目的基因进行遗传改造的方法。该方法通过两次基因组同源重组来实现基因组无痕改造，包括：
（1）选择性标志基因的插入
（2）目的基因遗传改造片段的替换。
本发明的优点：
（1）操作步骤简单、易于实施，改造准确性高、效率高；
（2）无痕改造，基因组中无多余序列残留；
（3）不涉及CRISPR基因组编辑方法；
（4）特别适合于对多个基因位点进行遗传改造。