项目简介： 中科院微生物所经过多年的潜心研究，目前成功开发了一整套能高效表达外源基因的汉逊酵母表达系统，以及适用于不同基因表达的受体菌，使一些较难表达的基因在其表达平台中获得较好的表达，建立了一整套从表达载体构建到产业化发酵和蛋白纯化的通用技术平台。 该系统可以以多种不同的碳源（甲醇、葡萄糖、甘油）进行诱导发酵，并可在贫氧状态下正常表达外源蛋白，解决了生产中使用纯氧造成的安全性问题，表达产物易于纯化（His-tag标记），表达量高。创建的表达平台己申请专利，使生产单位的知识产权得到保护。 项目现状： 目前该项目组开发的高效表达外源基因的汉逊酵母表达系统包括19个表达载体，可根据外源基因的种类不同，每升发酵液的表达量可达0.1—10 g，适合大、中、小规模的企业选用。获得专利5项，建立了一整套从表达载体构建到产业化发酵和蛋白纯化的通用技术平台。 （一）重组外源蛋白工业化生产技术平台 项目组采用目前为止外源真核基因表达量最高的汉逊酵母系统表达了乙肝表面抗原、pre-S1-S、pre-S2-S、pre-S1S2-S、治疗性乙肝疫苗、人乳头状瘤病毒L1蛋白、HIV七肽重复区、狂犬病毒G蛋白、霍乱毒素无毒亚单位、mVP1-CTB、、牛促卵泡激素、a干扰素、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、木薯醇晴酶、菊酸乙酯酯酶等基因。采用多拷贝胞内表达和分泌表达等不同的表达方式。发酵诱导后，收获菌体或者表达上清液，经纯化后可获得（纯度>98%）具有生物学活性的外源蛋白。项目组可提供稳定高效表达的工程菌和发酵条件以及参考的提取工艺。 （二）粘膜免疫技术平台 CTB为His-tag标记的霍乱毒素B亚单位，它是迄今为止最强的胃肠道免疫原，能和哺乳动物细胞肠上皮细胞上的GM1结合后，刺激粘膜产生以分泌型IgA为主的保护性抗体，构建了粘膜疫苗平台，以CTB为基础加上不同的抗原表位构成粘膜免疫疫苗。该项目组利用已经建立的Hansenula polymorpha表达系统中的pHFMDHZ-α-A分泌型表达载体，表达了mVP1-CTB。其中mVP1为口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因上的第21-40，135-160，200-213氨基酸，通过人工合成拼接而成，该基因含有T、B细胞表位，能刺激产生保护性T细胞免疫和体液免疫。表达产物免疫Balb/c小鼠后，能产生高效价的IgG（1：10000）和IgA（1：1000）抗体。并能保护Balb/c小鼠和猪对105 LD50剂量的FMDV-O-type的攻击。建立了Hansenula polymorpha-粘膜免疫技术平台。该平台用于预防所有通过粘膜和呼吸系统感染的疾病。其中口蹄疫Hansenula polymorpha酵母粘膜免疫技术已经完全成熟,可以直接进行产业化生产。此平台可用于口服或粘膜免疫疫苗的研发。 （三）汉逊酵母糖基修饰人源化表达平台 在哺乳动物细胞中表达基因工程药物，具有生产成本高、周期长、易于污染人源性致病因子等缺点。因此，对酵母宿主菌的糖基化进行人源化改造，使其完全按照人体内蛋白进行糖基化修饰，将是高新医药领域的一次重大变革。由于该技术是一项平台型技术体系，可以应用于所有治疗性重组蛋白，包括重组抗体。而对于目前的重组抗体，即便是嵌合抗体也有较大的免疫问题，使其成为治疗性抗体的一个瓶颈，因此如果在酵母体内解决人源性问题，将带来重组抗体技术的重大突破。目前国外最近已经完成了毕氏酵母表达人源化抗体的实验室工作，推测1—2年后会出现商品化产品。汉逊酵母人源糖基化问题有望给我国生物技术制药带来新的契机。此项研究正在进行，并取得了实质性进展，有望在近期内完成受体改造，表达出人源糖基化蛋白。 （四）高效筛选平台 由于汉逊酵母随机重组率很高，筛选稳定高表达克隆工作量很大。我们构建了目的基因和筛选基因共表达体系，可以直观筛选高表达株，减少了筛选工作量，缩短筛选周期，可快速高效获得高表达株。 应用领域： 此平台可广泛用于生物医药、食品工业、饲料工业、精细化工、化装品等重组蛋白制品。